2. Líquenes

Los líquenes son organismos complejos que resultan de la simbiosis de algas con hongos. No tienen una cutícula bien desarrollada o raíces y son capaces de absorber las sustancias en forma gaseosa, líquida o en partículas para obtener nutrientes minerales a través de su tallo. Además, son capaces de acumular muchos elementos químicos durante largos períodos de tiempo, a niveles muy por encima delas concentraciones ambientales y sus propias necesidades fisiológicas. Estas características. junto con la facilidad con la que pueden ser recopilados, hacen que los líquenes sean ideales como indicadores para los patrones de control de contaminación del aire.

A continuación presentamos un ejemplo de la revista  Environmental Geology  37 (3) March 1999 en la cual se emplean líquenes como bioindicadores en áreas volcánicas. El objetivo de este trabajo es verificar si tienen capacidad de acumular contaminantes atmosféricos vinculados a la actividad volcánica.

Cerca de 100 líquenes fueron recogidos en dos áreas volcánicas activas en Italia: el monte Etna y Vulcano. Se analizaron 27 elementos en cada líquen usando Análisis Instrumental de Activación neutrónica y Espectrometría de Masas de Plasma Acoplado. La composicición del líquen refleja la contribución de partículas volcánicas por lo que, las dos áreas investigadas se pueden distinguir en función de algunos de los elementos. Por otra parte, la distribución de los elementos en los líquenes (As, Sb, Br, Pb) - derivados de las emisiones (pluma, fumarolas) - también muestra diferentes tendencias geoquímicas en el monte Etna y Vulcano.

El monte Etna es un volcán basáltico-álcali, mientras que Vulcano pertenece a la serie calco-alcalina. Por tanto, estos volcanes representan un laboratorio natural para comprobar si los líquenes permiten:

• Reconstruír diferentes entornos volcánicos sobre la base de las composiciones químicas de los contaminantes acumulados.
• Discriminar las fuentes principales de los elementos absorbidos de una zona determinada.

Para este fin se tomaron 55 y 32 ejemplares de líquenes epiphytic del monte Eltan y la isla Vulcano, respectivamente, y en cada líquen se analizaron 27 elementos: Al, As, Ba, Br, Ca, Ce, Co, Cr, Cs, Fe, Hf, K, La, Mg, Mn, Na, Pb, Rb, Sb, Sc, Ta, Th, Ti, V.

En el laboratorio, los tallos se limpiaron para eliminar restos de sustrato y se examinaron con precisión mediante microscopio. A continuación las muestras se lavaron con agua desionizada y se secaron durante 24 horas a 40 ºC; posteriormente se aplastaron en un mortero de ágata.

Los análisis químicos se realizaron, como dijimos antes, mediante INAA e ICP-MS. Las muestras analizadas por INAA se irradiaron mediante un reactor ORPHEE. y las analizadas mediante ICP-MS se disolvieron en HNO₃-H₂O₂ en microondas.

Como resultado de este estudio, se puede decir que los líquenes tienen una gran importancia en el monitoreo de la calidad del aire en áreas volcánicas activas. Como regla , los líquenes que crecen en el mismo área muestran relaciones similares en el contenido de elementos.

Hay una alta correlación entre la concentración de elementos litófilos y la concentración de elementos geológicos de referencia tanto en el monte Etna como en Vulcano. Por tanto, el contenido de partículas clásticas atrapdas en los líquenes se puede relacionar directamente al sitio donde crecieron.

1. Musgos

En el artículo que presentamos a continuación de la revista Environmental Monitoring and Assessment 71: 13-50, 2001 se estudia el uso de musgos para la vigilancia de la contaminación atmosférica de metales. Se discute la naturaleza de los musgos, los mecanismos de los mismos para la captación de los metales pesados a partir de la precipitación y la humedad del aire, las diversas formas en que los musgos son utilizados para este propósito, y los casos en los que los musgos se han empleado para el seguimiento de puntos calientes locales de contaminación. También se destacan cuestiones de absorción por metales a partir de los sustratos, las diferencias entre especies, y una comparaciñon de la eficacia de los musgos con materiales de otros indicadores, ente otro temas.

Por qué se emplean musgos como bioindicadores 

• Acumulan contaminantes del aire con facilidad
• Los niveles de contaminación en sus tejidos varía en función de su distancia desde la fuente
• Son sensibles en su morfología a los cambios importantes en la contaminación
  

Los metales en suspensión en el aire llegan a la superficie de los musgos a través de procesos físicos de sedimentación, impactación y difusión, o por medio de partículas en el aire depositado en las precipitaciones.
En este artículo se han estudiado las propiedades de intercambio iónico en el Sphagnum y otros musgos y se encontró que los tejidos de los musgos se saturaban fácilmente con altas concentraciones de iones de hidrógeno y metales ligeros, que eran también fácilmente desplazados por metales pesados con mayor potencial de intercambio iónico. La capacidad de unión de cationes en el Sphagnum es alta. El intercambio iónico también se ha estudiado en especies epífitas como Hylocomium Splendens, Grimmia Doniana, Rhacopilopsis trinitensis y Gratum Thuidium, entre muchos otros. En  Hylocomium Splendens, la retención de los metales estaba en orden de  Cu >Pb >Cd .Estudios de microscopía  electrónica han demostrado que el metal puede ser absorbido a cabo ya sea en la región extracelular  fuera del citoplasma, unido a la pared celular, o en el núcleo de las células de las hojas. Se hicieron estudios de absorción en musgos. poniendo a prueba la capacidad de los mismo para retener metales pesados absorbidos en condiciones distintas de lixiviación. Los musgos que se emplearon para sorber distintos metales pesados se equilibraron con concentraciones variables de extractantes tales como EDTA, ácido acético, ácido mineral diluído, calcio, magnesio, sodio, potasio, etc. Casi en todos menos unos pocos casos, la fracción de metal sorbido es insignificante. Sin embargo, en la trinitensis Rhacopilopsis, Stereophyllum virens y Gratum Thuidium la equilibración con 0,1 M ácido nítrico da un promedio de 88-95% de cadmio, 40-75% de plomo, y 22-30% de cobre a artir del tejido de musgo.              

En la mayoría de las investigaciones se han utilizado musgos epífitos que crecen naturalmente en un lugar determinado. Estos musgos se pueden encontrar cada vez más en las rocas, cortezas de árboles, paredes o suelos forestales, y pueden ser de los tipos acrocarpous o pleurocarpous. En esta forma de aplicación, el musgo es muestreado en el sitio elegido y se analiza para obtener resultados que reflejen el nivel de contaminación del sitio. Se han empleado muchas especies de musgos, pero quizás las especies más utilizadas sean Hypnum cupressiforme, Hylocomium splendens y Pleurozium schreberi.

Las altas concentraciones de contaminantes atmosféricos tales como dióxido de azufre y partículas de metales pesados son perjudiciales para el pleno desarrollo de los musgos. Se ha demostrado que la morfología, anatomía y reproducción de éstos, se ven afectados por las altas concentraciones de contaminantes. Esta sensibilidad de los musgos se ha explotado para estudios fitosociológicos en los que la población de ciertas especies en determinados lugaros, y la medida de daños en la morfología de las plantas, se utiliza para calificar el nivel de contaminación.

Folken y Anderson-Bringmark han estudiado el efecto del cobre y el zinc en el aire alrededor de una fundición de bronce en la cubierta del musgo. Encontraron una disminución en la cobertura de las especies de musgo Pleurozium Schreberi, Hylocomium splendens, polysetum Dicranium y Ptilium crista.costrensis en los niveles de Cu y Zn en los tejidos. Bengtson encontró que en algunos puntos cercanos a la fundición, donde los niveles de Cu y Zn fueron 17 y 10 veces los respectivos niveles de fondo, los segmentos del musgo fueron 30-33% más pequeños, 50-65% más ligeros, y la biomasa se redujo en un 54%.

Para la determinación analítica de los metales en musgos se emplea la espectrofotometría de absorción atómica con llama. Sin embargo, también se utilizan otras técnicas como el análisis por activación neutrónica, fluorescencia de rayos X, voltamperometría de redisolución anódica, la espectroscopía de emisión atómica con plasma y la emisión de espectrografía. Para mejorar aún mas la precisión de los resultados del análisis de musgos para metales, se han hecho disponibles comercialmente, materiales ambientales de referencia.

Han estudiado diversos métodos de preparación de muestras de musgo para la determinación de metales pesados y encontraron, que la digestión con ácido nítrico- perclórico fue más eficiente que la extracción a temperatura ambiente con ácido nítrico. 

Algunas de las limitaciones que se han destacado son:

• Posibilidad de desplazamiento preferencial de un metal por otro
• Absorción de los metales del sustrato
• Absorción del suelo y el polvo atrapado
• Variación de los niveles de metal con diferentes especies de musgo
• Dilución del contenido de metales por temporada
• Variaciones en la capacidad de acumulación entre especies

Estos factores se vuelven más significativos cuando la magnitud de la contaminación por metales y los gradientes en los niveles de contaminación son mínimos. Tales limitaciones deben investigarse más a fondo para optimizar y estandarizar los procedimientos para el muestreo de musgos y la interpretación de los datos. A pesar de estas limitaciones sin embargo, este método se ha consolidado como una técnica de vigilancia de la contaminación valiosa y ampliamente utilizada.

                                               
                                                                    Pleurozium Schreberi    

                                                                
                                                                    Hypnum cupressiforme

         
                                                                    Hylocomium splendens

BIOINDICADORES TERRESTRES

Los bioindicadores Nicotiana tabacum (planta de tabaco), Populis nigra (álamo), Lolium multiflorum italicum (bacillo italiano) y Brassica olerocea acephala (col rizada) fueron expuestos al aire en 90 sitios de monitoreo de acuerdo a métodos estandarizados. Se evaluaron las lesiones visibles, los parámetros de crecimiento y la acumumlación de sustancias tóxicas en las hojas.

La reducción de las emisiones ha tenido éxito en las últimas décadas, pero la contaminación del aire sigue siendo un motivo de preocupación en muchos países de Europa. Actualmente el transporte es la fuente más considerable de contaminación.

Los resultados obtenidos mediante esta clase de bioindicadores no permite obtener conclusiones directas sobre los efectos de las concentraciones determinadas en los organismos vivos como respuesta a los contaminantes ambientales ya que, no sólo depende de la dosis de contaminante, sino también de muchos otros factores internos y externos como el clima, la nutrición, la predisposición y la edad. Además la simultánea exposición a diferentes contaminantes puede alterar la sensibilidad de los organismos a los contaminantes.

En particular, los efectos de la exposición crónica a bajas concentraciones de diferentes contaminantes dificilmente puede ser detectado por medio de las mediciones convencionales. Por tanto, es de gran importancia  para el control de la calidad del aire  verificar si las concentraciones de los contaminantes medidos causan efectos negativos sobre los organismos vivos.

El biomonitoreo es un método adecuado para detectar y vigilar los efectos de contaminación del aire, la utilización  de  bioacumuladores como las plantas, en las cuales se acumulan las sustancias tóxicas en sus tejidos y  especies indicadoras sensibles que responden al ambiente, la contaminación del aire proporciona lesiones visibles sobre el impacto de la contaminación argumentando con datos obtenidos por mediciones físicas y químicas.

La bioindicación hace posible que los problemas de contaminación del aire se hagan visibles y podamos ver como afectan a las personas en su vida cotidiana. Esta es la base del proyecto de la evaluación de la calidad del aire por el uso de plantas bioindicadoras (EuroBionet) en 1999. 

El Programa de la Comisión Europea, tiene como objetivo el establecimiento de redes locales de bioindicadores con bajos métodos estandarizados con el fin de:


-Establecer el uso de bioindicadores para la evaluación de la calidad del aire urbano a nivel europeo.
-Contribuir a la normalización de los métodos.
-Analizar y Evaluar la calidad del aire urbano en Europa.
-Comparar todos los tipos de contaminación en las diferentes ciudades y regiones.
-Demostrar los efectos de los contaminantes del aire de una manera fácil y comprensible.
-Contribuir a una sensibilización de la población urbana hacia las cuestiones medioambientales.
-Estimar las iniciativas en las escuelas, empresas , autoridades públicas y los hogares privados.
-Utilizan el compromiso de la ciudad para la protección del medio ambiente en campañas de marketing municipales.

A continuación se presentan la estructura del proyecto, los métodos de bioindicación 

Participan en EroBionet: Copenhague y Dusseldorf (Dinamarca), Edimburgo, Glyfada y Sheffield (Gran Bretaña), Klagenfurt (Alemania), Valencia y Cataluña (España), Grand Lyon y Nancy (Francia) y Verona (Italia).

Especies de bioindicadores empleadas:

• Nicotiana tabacum (tabaco) para la evalución de la capa de ozono. La especie sensible al ozono el Bel W3 que se cultiva a partir de semillas de acuerdo con el proyecto de la directiva VDI 3957/6. Se expusieron 4-6 plantas en cada estación durante 8 períodos consecutivos de 2 semanas cada uno entre finales de mayo y mediados de septiembre. Al final de la exposición, el porcentaje de lesiones provocadas por el ozono  se estima en pasos del 5% de área foliar con un catálogo fotográfico.
• Populus nigra (Chopo). Las estacas del álamo permiten determinas las lesiones provocadas por el ozono. Son expuestas continuamente en cada una de las estaciones de bioindicadores para todo el período, entre finales de mayo y mediados de septiembre. Se determina el número de hojas con lesiones visibles y la altura de brotes cada 2 semanas.

• Brassica oleracea acephala (col rizado). Se exponen 4 plantas en cada estación durante un período de ocho semanas entre octubre y diciembre. La concentración de PAH de una muestra mixta, se predetermina mediante CG-MS.
• Lolium multiflorum italicum (hierba italiana). Se genera un cultivo estándar de pasto y se expone siguiendo el proyecto de la directiva VDI 3957/2. Los períodos de exposición se llevan a cabo entre mayo y octubre. La hoja muestreada se seca, se muele, se dijiere en un horno microondas y se analiza para el contenido en metales pesado por AAS. El polvo de la hoja seca es utilizado para la determinación de las concetraciones de azufre utilizando un analizador automáticcco.
• Micronúcleos de Tradescantia. Las pruebas se llevan a cabo mediante un protocolo estandarizado . Las estacas son llevadas a las ciudades participantes por servicio de  mensajería .Después de 24 horas de recuperación , 15 cortes son expuestos en cada estación de 12 a 20 horas. Luego se vuelven a muestrear en el centro de coordinación , donde se forman micronúcleos a partir de las células madres de polen, los cuales son anotados.

Para el cultivo de todas las plantas se hace una mezcla del tipo de suelo ED73 y arena de río , excepto con la hierba de centeno donde el tipo de suelo es 0 (sin fertilizantes) y las soluciones de nutrientes se toman a partir de productos químicos.Todas las plantas son cultivadas en macetas de plástico en un invernadero , utilizando un sistema de riego semiautomático .La exposición del tabaco, col rizado y álamo en el campo a1 -1,2 m sobre el suelo, con cuencas de plástico como reservas de agua , en el caso de la hierba se lleva a cabo a 1,5 m sobre el suelo. La Tradescantia, se expone en pequeños recipientes recubiertos con tela a una altura de 2 a 2,5 por encima del suelo.

La evaluación de daños y toma de muestra se lleva a cabo por diferentes métodos dependiendo del grupo de trabajo.

Populus nigra

Lolium multiflorum italicum

Nicotiana tabacum

Tradescandia

Brassica oleracea acephala

 

4. Peces

En general, los peces son considerados buenos indicadores de la calidad del medio, por lo que una gran diversidad y abundancia de peces en ríos, lagos y mares indican que es un ambiente sano para todas las demás formas de vida. Por el contrario una elevada mortandad o un porcenataje alto de peces enfermos podrían ser causados directa o indirectamente por niveles considerables de contaminantes.

Este grupo muestra ciertas ventajas como herramienta para determinar la calidad del agua:

• Las comunidades generalmente comprenden una amplia variedad de especies que representan diferentes niveles tróficos, incluyendo especies que consumen alimentos tanto de origen acuático como terrestre.
• Los peces son los organismos mejor conocidos de  hábitats acuáticos.
• Están presentes en los pequeños cuerpos de agua y aún en aquellos ecosistemas son ciertos niveles de contaminación.

En este caso presentamos un ejemplo de la revista Ecological Indicators (2011) 311-317 en la cual se describe una clasificación de los peces basada en la toleracia de los parámetros físico-químicos de agua y hábitat.
Se muestrearon 430 sitios que cubren una amplia gama de condiciones del río, que nos permite desarrollar las puntuaciones de tolerancia sobre la base de una evaluación cuantitativa.
Se elaboró una clasificación de tolerancia de las especies más comunes en base a los datos obtenidos de los diferentes modelos: la calidad del agua y el estado físico del hábitat. Los resultados corroboran el uso de especies de peces (incluídos los exóticos) como indicadores biológicos. De esta manera se pueden utilizar como un índice residual de la integridad biótica basada en las puntuaciones.
Los ríos mediterráneos tienen una larga historia de asentamientos e impactos humanos, exhibiendo la más alta contribución antropogénica de cualquier zona climática. Los impactos provocan modificaciones de los canales, los bancos de peces, la regulación de flujo, la fragmentación y contaminación química.
Se recogen datos que comprenden 430 sitios de muestreo a lo largo de cuencas interiores de Cataluña, el río Ebro, cuencas de Senia y parte de la cuenca de Garona, teniendo en cuenta una serie de características.
Se realizó un tratamiento de datos mediante técnicas quimiométricas. Este estudio propone una clasificación de la tolerancia basado en los datos cuantitativos que se resumen en dos gradiente: calidad del agua y el estado físico del hábitat. Para demostrarlo se realizó la clasificación de ocho especies y la posterior estimación en categorías de otras ocho especies. Dichas categorías pueden ser complementadas por otros índices fisiológicos sobre la base de datos mediante procedimientos no invasivos de muestreo (por ejemplo, parátros de sangre) debido a la situación de conservación de muchas especies nativas.

3. Fitoplancton

El fitoplancton responde rápidamente a los cambios ambientales por su ciclo de vida corto. Estos cambios alteran la estructura de sus comunidades, repercute en el interés socioeconómico del sistema acuático en tiempos relativamente cortos, sobre todo por su papel de productores primarios. Algunas algas microscópicas del fitoplancton muestran una distribución amplia, otras, ciertas preferencias ambientales, y unas terceras alta frecuencia de taxón en aguas fuertemente contaminadas, lo que sugiere su tolerancia o preferencia por algún compuesto químico o bioquímico. Si algún taxón se reconoce como cosmopolita diferenciado, puede evidenciarse cualquier campo físico o químico en las masas de agua al ocurrir una alteración por contaminantes.

El fitoplancton puede adquirir mayor resistencia o tolerancia a diversas sustancias, por ejemplo fertilizantes, e incrementar su desarrollo y abundancia repercutiendo a la eutrofización de las aguas, donde ciertas especies muestran el estado trófico de arroyos, ríos y lagos.

En este caso presentamos un ejemplo de la revista Journal of Environmental Management 95 (2012) 571-576 donde emplean fitoplancton como bioindicador de lagunas de estabilización.

Comenzamos describiendo lo que es una laguna de estabilización; se trata de una tecnología apropiada para el tratamiento de las aguas residuales domésticas la cual,es de bajo coste, requiere poco mantenimiento y es muy eficaz, natural y sostenible.

Se analizaron los flujos de entrada los cuales, se midieron utilizando un medidor de flujo ultrasónico después de pasar por un tanque de sedimentación.

Las aguas residuales en bruto (después de la sedimentación, muestras en el tanque) de entrada y salida fueron analizadas de acuerdo con métodos estándar, entre los que se incluyen:

• pH, sólidos suspendidos totales (SST),
• demanda química de oxígeno (DQO),
• DBDS
• nitrógeno total (NT),
• fósforo total (PT),
• coliformes fecales(CF) y 
• clorofia (Cha)   

Parámetros como:

• temperatura (T)
• oxígeno disuelto (OD) y
• conductividad eléctrica (CE) se midieron semanalmente in situ  a las 11 horas, cada 10 cm de agua en un estanque con una sonda.

Las muestras de agua (100 ml ) para la determinación de fitoplancton y la composición de la biomasa del zooplancton se recolectaron semanalmente en dos puntos de cada estanque. Muestras de agua superficial se recogieron a 1 metro de distancia de la orilla.

Las muestras frescas fueron utilizadas para la identificación y enumeración de plancton que se fijaron con solución de lugol. El fitoplancton identificado fue llevado a cabo utilizando la microscopía óptica.

La determinación de la abundancia del fitoplancton se realizó con la técnica Uternol y la enumeración del mismo se realiza en una cámara de sedimentación utilizando el microscopio óptico invertido. Se realizó un análisis del rango de correlaciones entre las variables de estudio.

La inspección fue llevada a cabo a diario.

Los resultados obtenidos muestran que las cianobacterias están presentes en menor concentración que las clorofílicas que están presentes cuando el estanque se encuentra sobrecargado.

Utilizando esta metodología con el tiempo puede obtenerse un patrón de todo el año para utilizar el fitoplancton como bioindicador de las condiciones del estanque.

  
   

2. Bacterias 

Las ventajas que presenta el uso de bacterias como indicadores de acuerdo con De la Lanza et al. (2000), es que el muestreo de este grupo tiene una metodología bien desarrollada y da respuesta rápida a cambios ambientales tales como la contaminación, básicamente por descargas domésticas y municipales.

Presentamos un ejemplo de la revista de investigación J Ind Microbiol Biotechnol (2009) 36:765-768 en la cual emplean "Bacillus subtilis" para determinar la concentración y toxicidad de pentaclorofenol (PCP) y su sal PCP-Na. Dichas sustancias químicas son responsables de la contaminación del suelo y de las aguas subterráneas, causadas por desechos de las plantas de tratamiento de madera.

Para el análisis de PCP Y PCP-Na se empleó cromatografía de líquidos (HPLC) y cromatografía de gases-espectrocopía de masas (GC-MS).

En este artículo se evalúa la biodegradación de PCP y sus derivados en muestras líquidas (mediante Bacillus subtilis) la cual, genera productos que son potencialmente tóxicos, mutágenos o teratogénicos .

Se prepararon disoluciones de Na-PCP, a las cuales les inocularon B. subtilis (10% v/v) durante una noche. Se realizaron tiempos de incubación de 48 horas a 120 rpm y 25ºC (el crecimiento era evaluado por A600). 

Posteriormente evaluaron los resultados con las diferentes muestras de B. subtilis expuestos a disoluciones de Na-PCP.

La concentración de Na-PCP en las muestras se determinó por HPLC, con el fin de ver la desaparición de Na-PCP y sus derivados. También se realizaron experimentos en paralelo para cuantificar y ver la correlación con el crecimiento de las bacterias, las cuales fueron creciendo en un matraz erlenmeyer con 0,5 mg de LB deshidratado a 25 ºC.

Después de 24 horas de incubación las células se sometieron a agitación a 14000 rpm. Las células se resuspendieron en 2 ml de disolución tampón de fosfatos. 

Cada dilución fue sembrada en 0,5 mg de LB deshidratado. Las placas se incuban a 25 ºC, y las colonias fueron contadas después de 48 horas y expresadas como: unidades de colonias formadas por ml (CFV/ml). El peso se determinó pesando las células después de un secado en horno a 105 ºC durante 24 horas.

El bioensayo es simple, barato, rápido y no requiere complejos procedimientos de preparación de muestras o sofisticados instrumentos analíticos.

Este trabajo aporta una herramienta eficaz que puede utilizarse en situaciones en las que la tecnología presenta limitaciones temporales.

Bivalvos

Presentamos un ejemplo de la revista de investigación Bull Environ Contam Toxicol (2012) 88:48-53 en la cual realizan la evaluación de tres tipos de bilvalvos (Lamellidens marginalis, Indonaia caeruleus, Lamellidens corrianus) , como bioindicadores. Éstos fueron aclimatados , se les midió la longitud de la concha y se dividieron  en 7 grupos:

1º Grupo: fue expuesto a condiciones normales.

2º Grupo: fue expuesto a  una concentración periódica 0,1719 ppm de As durante 30 días.

3º Grupo: fue expuesto a una concentración de 0,1284 ppm de Cd durante 30 días

4º Grupo: fue expuesto a una concentración de 0,033 ppm de Cu durante 30 días

5º Grupo: fue expuesto a una concentración de 0,0443 ppm de Hg durante 30 días

6º Grupo: fue expuesto a una concentración de 1,50 ppm de Pb durante 30 días

7º Grupo: fue expuesto a una concentración de 1,8589 ppm de Zn durante 30 días

Tras la exposicioón de 10, 20 y 30 días de período de exposición y la masa de cuerpo entero de cada material se seco en una estufa a 70-80 ºC . Después del secado se llevo a cabo la medida.

Los tejidos se digirieron en 10 ml de ácido nítrico:ácido perclórico (5:1). Después de media hora de agitación , las muestras se dejaron durante la noche en reposo y al día siguiente fueron digeridas sobre la placa calefactora añadiendo 10 ml de mezcla ácido nítrico:ácido perclórico gota a gota. Después de enfriar se enraso en un matraz aforado de 50 ml , y la disolucíón se filtró .

Cada muestra de metal respectivamente se analizo media AAS (Espectrofótometría de absorción atómico).

El peso seco de cada animal se utilizo para calcular la concentración de metal por unidad de peso corporal y el metal en carga corporal .

Se observo que:

-Lamellidens corrianus , presentó concentraciones más altas en plomo y arsénico.

-Lamellidens marginalis, presentó concentraciones más altas en zinc 

-Indonaia caeruleus, presentó concentraciones más altas en mercurio, cadmio y cobre